针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

摘要：

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系.本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是FbxN的第五号外显子上.首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎.最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测.首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基.证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础.

关键词：Fbxl5、F-box基因家族、CRISPR/Cas9、基因敲除

所属期刊栏目：25

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金面上项目81470377,81270156;湖南省科教支撑计划项目2014SK3099;湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心2013-448-6

在线出版日期：2017-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：559-563