mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立
目的 建立信使RNA(mRNA)电转抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)的方法,为制备基因修饰CDR3δ移植型yδ T淋巴细胞,为肿瘤细胞过继治疗提供新的技术方法.方法 以SpeⅠ内切酶消化重组pGEM4Z/EGFP/A64质粒,回收纯化线性化的重组质粒pGEM4Z/EGFP/A64,体外转录成mRNA;在电转参数为500 V500 μs 、400 V 500 μs或300 V 500μs等不同条件下,转染抗CD3抗体刺激的人PBMC;用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪观察和分析绿色荧光蛋白的表达;台盼蓝染色计算不同电转条件下细胞的存活率,以确定mRNA电转最佳条件.结果 pGEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切,获得了线性化的质粒;体外转录得到了增强型绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA;与其他转染条件相比,在500 V 500 μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转后48 h绿色荧光蛋白表达量较高;与其他转染条件相比,在500 V 500μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转48 h后绿色荧光蛋白表达的阳性细胞高达77％;台盼蓝染色分析不同电转条件下细胞的存活率,在细胞电转48 h后,500 V 500 μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85％以上.结论 电转参数为500 v 500μs的条件可用于电转mRNA于抗CD3抗体扩增的人PBMC,以制备基因修饰T淋巴细胞.
信使RNA、电转、外周血单个核细胞、加强型绿色荧光蛋白
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R392.12
国家高技术研究发展计划863计划2012AA020901
2014-07-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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