利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应
目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA (shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率.方法 分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒；将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组；将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度.病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定.结果 成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100％；且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P＜0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P＜0.01).结论 携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默.
RNA干扰、shRNA、腺病毒载体、悬浮细胞
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R730.54(肿瘤学)
国家自然科学基金30600270
2013-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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