shRNA表达载体的改建及鉴定

摘要：

目的 通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存.方法 制备含有单一限制性内切酶Not Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段,与BamH Ⅰ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-Ha/Not Ⅰ,再用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ,将含靶向目的 基因JAK2 siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用Not Ⅰ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被Not Ⅰ切开的质粒进行测序鉴定.随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达.结果 通过测序证实pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ和含JAK2 siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达.结论 通过对 pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体.

关键词：RNA干扰、小发卡RNA、基因沉默、表达载体

所属期刊栏目：31

分类号：Q789(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金30560038;贵州省国际科技合作重点项目计划黔科合外G字,700119

在线出版日期：2013-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：78-83