一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量RT-PCR检测方法及其应用

摘要：

青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一,青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业的高质量发展造成了重大威胁.为从源头切断该病原的感染和传播,本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法.为最大限度地提高检测灵敏性,首先,本研究分析MCRV在感染青蟹主要组织中的含量,发现血淋巴中病毒载量最高;随后,分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平,发现病毒VP11基因相对表达量最高;最后,基于VP11基因序列保守区设计特异引物,建立了一种SYBR Green quantitative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测方法,该方法可精确检测的病毒下限为50copies/反应.该检测方法具有组织和靶标基因选择优势,灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法.使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测,均无特异性扩增.抽取微量血淋巴(大约50 μL/只)提取RNA,随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测,阳性率分别54.44％和85.00％.此外,利用该方法进一步分析了 MCRV在较低温度下(21 ℃)在青蟹体内的增殖情况,发现病毒感染早期MCRV呈指数方式增殖,随后进入平台期,实验周期内无青蟹死亡.总之,本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法,既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选,也能满足病原感染相关研究的需要.

关键词：MCRV、检测方法、青蟹种蟹、定量RT-PCR

所属期刊栏目：44

分类号：S945(水产保护学)

资助基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目;上海市自然科学基金;中国水产科学研究院基本科研业务费共同资助

在线出版日期：2023-10-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：172-181