杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

摘要：

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类.杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16SrDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分.为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法.根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果.结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段.杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为 64 ℃,10 μmol/L 引物、2mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD 酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL.杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10 μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/LMgSO4和 1 U/μL KOD 酶的最适添加量分别为 0.75、1、1.5 和 0.5 μL.以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带.该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2fg/反应(DNA).利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原.综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法,该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑.

关键词：杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种、PCR、检测

所属期刊栏目：44

分类号：S942.2(水产保护学)

资助基金：国家重点研发计划;中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费;国家自然科学基金

在线出版日期：2023-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：223-233