机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导牙周膜干细胞成骨分化作用机制研究

摘要：

目的 探究机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导人牙周膜干细胞(hPDLSC)成骨分化作用机制.方法 选取自2016年1月1日—2018年1月1日就诊于北京儿童医院正畸科的8～14岁儿童因阻生而拔出的年轻恒牙的牙周膜组织为细胞来源,采用酶消化法对hPDLSC进行提取.采用免疫组织化学染色法检测角蛋白、波形蛋白的表达和流式细胞术对hPDLSC的标志物CD146和STRO-1进行鉴定.构建和筛选siRNA-Piezo1基因干扰载体和Piezo1基因过表达质粒.应用Flexcell 4000T机械牵张应力仪器构建体外牵张力学hPDLSC细胞模型.实验分成5组:siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组.荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Piezo1、Notch1和成骨基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关基因2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表达.Western blot检测成骨标志蛋白ALP和Runx2的表达.Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子含量.结果 hPDLSC波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性.流式细胞仪检测hPDLSC标志物STRO-1表达阳性,CD146表达阳性.空病毒载体、siRNA-Piezo1干扰序列和Piezo1过表达载体序列均可以通过慢病毒转染hPDLSC,而且转染效率较高,均在90％.逆转录聚合酶链反应结果显示,siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组Piezo1 mRNA的表达水平差异有统计学意义(F=9.573,P<0.05);过表达组Piezo1 mRNA的表达水平明显高于siRNA干扰组,差异有统计学意义(q=3.893,P<0.05);牵张应力组Piezo1 mRNA的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(q=2.006,P<0.05).Notch1和成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的mRNA表达具有同样的趋势.Western blot检测结果显示siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组成骨标志蛋白ALP蛋白表达差异有统计学意义(F=11.207,P<0.001);过表达组ALP蛋白的表达水平明显高于siRNA干扰组,差异有统计学意义(q=2.991,P<0.05);牵张应力组ALP蛋白的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(q=3.007,P<0.05).Runx2蛋白表达具有同样趋势.细胞内钙离子检测结果显示,过表达组和牵张应力组细胞内钙离子荧光强度明显高于siRNA干扰组.结论 机械牵张应力可以促进Piezo1蛋白的表达,以Ca2+为第二信使,激活Notch1信号通路,激活ALP、Runx2、OCN和BSP的表达,促进hPDLSC成骨分化.而siRNA-Piezo1干扰质粒可以阻断这一进程,反之,Piezo1的过表达质粒可以促进hPDLSC成骨分化进程.

关键词：人牙周膜干细胞、机械激活离子通道、Piezo1、分化、信号通路

所属期刊栏目：38

分类号：Q257(细胞生理学)

资助基金：河北省高等学校科学技术研究项目Z2019023

在线出版日期：2020-12-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：628-636