人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
目的:构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列(shRNA1~3),通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Westernblot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90%以上。QRT-PCR和Westernblot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论成功构建了人Notch-1RNAi慢病毒载体。
Notch-1基因、慢病毒载体、RNA干扰
R782(口腔科学)
国家自然科学青年基金资助项目81102051;江苏省自然科学基金面上资助项目BK2011659
2014-07-15(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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