应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

摘要：

经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73 倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol·L-1升高至0.63 mmol·L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol·L-1升高至0.77 mmol·L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65 ℃降至55 ℃.

关键词：甘油脱氢酶、克雷伯杆菌、定向进化、易错聚合酶链式反应

所属期刊栏目：31

分类号：Q554+.903(酶)

资助基金：国家重点基础研究发展973计划项目2006AA020103;国家自然科学基金资助项目20676048

在线出版日期：2011-01-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：661-666