10.3969/j.issn.1671-7171.2015.05.001
pTracer-CMV/Bsd-BDNF真核表达载体的构建及表达
【目的】构建人脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,并在小鼠耳蜗毛细胞与螺旋神经节细胞(SGCs)表达。【方法】应用RT‐PCR从人外周血中扩增BDNF基因开放阅读框(ORF),采用 TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm‐T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm‐T‐BDNF。随后,将BDNF进一步克隆到真核表达载体pT racer‐CM V/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pT racer‐CM V/Bsd‐BD‐NF质粒转染小鼠耳蜗SGCs细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染SGCs细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用Western blot检测BDNF的表达。【结果】成功构建了pTracer‐CMV/Bsd‐BDNF真核表达质粒,转染SGCs细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;Western blot检测结果表明,所转染的BD‐NF在SGCs细胞中成功表达。【结论】成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和BDNF的真核表达质粒pTracer‐CMV/Bsd‐BDNF ,为进一步研究BDNF在内耳基因治疗中的作用奠定了基础。
脑源性神经营养因子/遗传学、耳蜗、螺旋神经节/细胞学、遗传载体、转染
R764.3(耳鼻咽喉科学)
湖南省科技厅项目2010FJ4124
2015-07-02(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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