CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定

摘要：

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定.将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白.对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃ 条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高.通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想.此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃ 条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L.综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法.

关键词：CRISPR/Cas13a蛋白、原核表达、镍柱亲和层析、连带剪切酶活性、核酸检测

所属期刊栏目：50

分类号：S855.3(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划;河南省科技攻关计划

在线出版日期：2021-05-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：147-153