小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定

摘要：

目的 克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性.方法 采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,BamH I和Xho Ⅰ双酶切扩增产物与真核表达载体pCDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒pCDNA3.1 (+)-mCCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物.脂多糖分别刺激转染有pCDNA3.1(+)-mCCSP和pCDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力.结果 聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pCDNA3.1 (+)-mCCSP构建成功且序列正确.Western blot结果显示,在转染pCDNA3.1(+)-mCCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 kDa,而转染空质粒组未见表达.CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力.结论 成功构建了真核表达重组体pCDNA3.1 (+)-mCCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础.

关键词：无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白、真核表达、脂多糖、磷脂酶A2

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分类号：R994.6(毒物学（毒理学）)

资助基金：国家自然科学基金81200032;山西省研究生优秀创新项目20123063;山西省回国留学人员科研资助项目2015-101;山西省留学回国人员科技活动项目择优资助2015

在线出版日期：2016-01-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：899-902