嗜热毛壳菌锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

摘要：

目的 克隆嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)锰超氧化物歧化酶(CtMnSOD)基因,进行毕赤酵母真核表达、纯化重组CtMnSOD蛋白,并分析其酶学性质.方法 提取嗜热毛壳菌总RNA,根据CtMnSOD基因全长编码序列(登录号为EF569987)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pPIC9K载体,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD经5acⅠ线性化后,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,并加入甲醇诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;重组CtMnSOD经硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化;并通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定酶学性质.结果 RT-PCR扩增产物约为684 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD构建成功.SDS-PAGE结果显示,经甲醇诱导获得约22.7 kDa的可溶性重组蛋白.酶活力分析结果表明,工程菌酶活力达906.23 U/ml;该重组酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;在70℃的条件下保温30 min后仍具有71％的酶活力.结论 CtMnSOD在毕赤酵母中高效分泌表达,该酶具有较高的热稳定性,具有较好的工业应用价值.

关键词：锰超氧化物歧化酶、嗜热毛壳菌、嗜热酶、毕赤酵母

所属期刊栏目：32

分类号：R117(卫生基础科学)

资助基金：山东省自然科学基金青年基金ZR2012CQ035;教育部大学生创新创业训练计划201410439003;泰安市科技局一般项目201440777-27

在线出版日期：2015-08-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：422-425