刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达
目的 克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性.方法 制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定.将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度.结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别.亲和纯化后获得纯度大于95％的重组TgPDI蛋白质.结论 克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性.
刚地弓形虫、蛋白质二硫键异构酶、克隆、原核表达、免疫反应性
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R994.6(毒物学（毒理学）)
国家自然科学基金81071374;山西医科大学科技创新基金01201103;山西医科大学基础学院331科技启动基金201202
2014-01-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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