腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取131I-FIAU的实验研究
用内部核糖体进入序列(IRES)将报告基因单纯疱疹Ⅰ型病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)连接,双启动子法将TK-IRES-BDNF与增强绿色荧光蛋白(EGFP)包装到重组腺病毒载体中,得到Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,扩增、纯化、测定病毒滴度;以感染复数(MOI)为0、50、100、150、200、250感染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),以重组腺病毒Ad5-EGFP为无效对照病毒.荧光显微镜下观察感染细胞的绿色荧光细胞阳性率.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染细胞增殖能力.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)诱导感染细胞向神经元细胞分化,显微镜下观察细胞形态变化.实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和2-ΔΔCT法分析两目的基因的相对表达量(CT).观察感染细胞对131I-FIAU的摄取情况.重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在MOI为150可高效感染BMSCs,感染细胞存活率>98%,且保持良好的神经元细胞诱导分化能力.RQ-PCR检测两目的基因随着腺病毒MOI增加表达增强,且TK和BNDF两基因的表达有良好的线性相关(r=0.973,P<0.05,n=3).在前3 h可见感染目的基因组细胞对131 I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关,3 h感染目的基因组对131I-FIAU摄取率可达(31.42±0.46)%(n=3),随后增加不明显.各点感染目的基因组摄取率均显著高于对照组(t=23.06-173.83,P<0.05,n=3).重组腺病毒载体能高效、低毒感染BMSCs,IRES介导两目的基凼表达有良好的线性相关.本研究表明感染目的基因细胞可有效介导HSV1-TK摄取131I-FIAU,为后续放射性核素报告基因活体显像示踪转基因BMSCs治疗脑梗死提供了细胞水平依据.
报告基因、干细胞、基因治疗、腺病毒
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R817.4(放射医学)
国家自然科学基金资助30770605
2010-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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