抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化
人工抗凋亡蛋白 PTD－Bcl－xL 能保护多种因素引起的细胞异常凋亡，为了获得高纯度 Bcl－xL 与 PTD（Protein transduction domains）的融合蛋白，首先采用 TRIzol 法提取 SD 大鼠肝脏总 RNA，将 RNA 反转录为 cDNA，设计引物以cDNA 为模板，PCR 扩增 Bcl－xL 基因，构建 pUM19－T－Bcl－xL 质粒，并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定；其次设计包含 PTD序列的 Bcl－xL 引物，以测序正确的 pUM19－T－Bcl －xL 质粒为模板，PCR 扩增 PTD－Bcl－xL 序列，将扩增序列克隆入 pET28a载体，构建 PTD－Bcl－xL 蛋白的原核表达质粒 pET28a－PTD－Bcl－xL，并对 pET28a－PTD－Bcl－xL 载体双酶切鉴定和测序鉴定；将 pET28a－PTD－Bcl－xL重组质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3），用 IPTG 诱导表达，并对 IPTG 诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化；SDS－PAGE分析表达蛋白的可溶性情况，在变性条件下用 Ni－NTA 琼脂纯化融合蛋白；最后用 SDS－PAGE、Western Blot 及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明：双酶切 pUM19－T－Bcl－xL 质粒出现约774 bp 大小条带，pUM19－T－Bcl－xL 质粒测序结果与 NCBI 数据库比对序列一致，表明成功构建 pUM19－T－Bcl－xL 质粒；双酶切pET28a－PTD－Bcl－xL 质粒出现约744 bp 大小条带，pET28a－PTD－Bcl－xL 质粒测序结果与预期序列一致，表明成功构建了pET28a－PTD－Bcl－xL 原核表达载体；在 IPTG 诱导下 pET28a－Bcl－xL 重组质粒在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达出36 kDa大小蛋白，最优 IPTG 诱导浓度为0．1 mmol／L，最佳 IPTG 诱导时间为6 h；SDS－PAGE 电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里，以包涵体形式表达，经 Ni－NTA 琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白；Western Blot 和质谱鉴定证明IPTG 诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为 PTD－Bcl－xL 蛋白。纯化得到了 PTD－BcL－xL 融合蛋白，推进了 PTD－Bcl－xL蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。
Bcl-xL 蛋白、PTD、原核表达、蛋白纯化
Q78(基因工程（遗传工程）)
广西科学研究与技术开发计划项目桂科能1598022－2；广西畜禽品种改良站横向科技项目20140220
2016-04-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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