棉花 GhMDH 基因的克隆及其蛋白诱导和酶活性分析

摘要：

分析棉花盐胁迫相关的EST文库，设计特异性引物，利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶（ Malate dehydrogenase ，MDH）基因，命名为GhMDH。基因全长1130 bp，最大开放阅读框1014 bp，编码338个氨基酸，分子量为35．495 kDa，等电点pI＝8．94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中，获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白，发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化，结果表明，除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶，其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了得到足够的重组蛋白，对GhMDH包涵体蛋白采用脲素缓冲液溶解，对提取液进行镍亲和层析柱纯化，对洗脱的产物经脲素梯度透析复性。利用生化测定法测定目标蛋白的酶活性，结果表明，克隆的GhMDH基因编码蛋白酶具有脱氢酶活性。以上结果为GhMDH在棉花体内氧化还原动态以及参与抗逆功能等研究提供前提条件。

关键词：棉花、苹果酸脱氢酶、基因克隆、诱导表达、包涵体

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金项目31271773

在线出版日期：2013-09-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：13-18