CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

摘要：

目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株.方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系.结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNA-VASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6％;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60％.结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础.

关键词：VASN、CRISPR/Cas9、Cre-Loxp系统、条件性敲除、AML12细胞

所属期刊栏目：40

分类号：R-33(医学研究方法)

资助基金：国家自然科学基金;广西高校中青年教师科研基础能力提升项目

在线出版日期：2023-04-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：173-181