萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌的构建与应用

摘要：

目的:构建稳定表达萤火虫荧光素酶(Luc)的马尔尼菲篮状菌(TM),并进行生长状况和毒力的评估,为TM研究提供新手段和新工具.方法:构建Luc基因表达质粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-Luc,通过琼脂糖凝胶电泳和测序手段验证质粒是否携带Luc基因.采用农杆菌介导转化法将Luc插入TM基因组,在含有潮霉素培养基上筛选转化成功的TM转化子(TM-Luc).于PDA培养基(27°C)中连续培养TM标准株ATCC18224和TM-Luc 14 d,记录二者的生长情况,挑取单个菌落进行乳酸酚棉蓝染色,荧光显微镜下观察两种菌株的形态.利用RT-qPCR和流式细胞术检测TM标准株和TM-Luc对THP-1来源巨噬细胞的杀伤情况.结果:经潮霉素筛选与电泳验证,得到稳定表达Luc的TM-Luc转化子.TM-Luc与荧光素底物结合后可发出荧光.在PDA培养基(27°C)连续培养14 d后,TM标准株菌落直径为(6.54±0.22)cm,TM-Luc菌落直径为(6.45±0.23)cm.两者表面均呈扁平绒毛状,并产生红色色素,生长曲线(P=0.273)与生长速率曲线(P=0.49)均无统计学差异(均P>0.05).荧光显微镜镜下TM标准株和TM-Luc形态相似.流式细胞术显示TM标准株对THP-1来源的巨噬细胞杀伤作用较强于TM-Luc,在48 h时差异具有统计学意义(P=0.0156),在72 h时差异无统计学意义(P=0.1033).炎症因子TNFA(24 h P=0.1529,48 h P=0.1115)与IL1B(24 h P=0.1338,48 h P=0.6921)在24 h、48 h表达差异均无统计学意义(均P>0.05).结论:TM-Luc与TM标准株形态学与功能学特征相似,可作为工具菌用于细胞感染和动物感染模型上,以便于更加直观地评估TM与宿主间的相互作用.

关键词：马尔尼菲篮状菌、萤火虫荧光素酶、标准株、农杆菌介导的转化

所属期刊栏目：39

分类号：R37(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：国家自然科学基金;广西自然科学基金资助项目;中国博士后科学基金资助项目

在线出版日期：2022-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1192-1198