利用CRISPR/Cas9技术构建ATF4基因敲除的HepG2细胞株

摘要：

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立ATF4基因敲除的HepG2细胞株.方法:针对ATF4基因作用的功能区域,设计靶向ATF4基因Exon 1(外显子1)和Exon 2(外显子2)的两对gRNA.构建PX459-ATF4-gRNA重组质粒并转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子后进行测序,通过测序验证所设计的gRNA的有效性.将PX459-ATF4-gRNA质粒转染到HepG2细胞中,挑选单克隆细胞,提取DNA,进行PCR检测与基因测序,获得敲除ATF4基因的细胞株.通过western blotting检测筛选出来的HepG2细胞ATF4基因的敲除效果.结果:菌落PCR与菌液测序结果显示PX459-ATF4-gRNA载体构建成功;PCR扩增电泳与基因测序检测显示成功构建成了ATF4基因敲除的HepG2细胞;western blotting检测结果显示单克隆2号ATF4蛋白不表达,单克隆3号仍表达ATF4蛋白.结论:成功构建ATF4基因敲除的HepG2细胞,为后续ATF4在肝癌中的作用机制和功能研究奠定基础.

关键词：ATF4、CRSPR/Cas9系统、基因敲除、肝癌

所属期刊栏目：35

分类号：R735.7(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81760454

在线出版日期：2018-06-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：603-607