红螯螯虾卵黄蛋白原VWD结构域的原核表达及纯化

摘要：

[目的]原核表达红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原(Vg)VWD结构域,为深入开展Vg的生物学功能研究和开发相应的生物活性物质提供技术支持,也为改进虾类养殖催熟及获取高质量后代打下基础.[方法]在GenBank中搜索红螯螯虾卵Vg的mRNA序列(AF306784.1)及查找其VWD结构域(2345～2491 aa),采用ExPASy ProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在线软件进行生物信息学分析及理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好优化原始VWD氨基酸序列;然后通过全基因合成获得目的基因,连接至载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-VWD,挑取阳性克隆转化大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞及采用IPTG进行诱导表达,并以10％SDS-PAGE电泳和Wes-tern blotting检测诱导表达的融合蛋白.[结果]红螯螯虾VWD结构域相对分子量为19692.11 Da,理论等电点(pI)为9.35,分子式为C855H1334N258O261S9,属于不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域.延伸链和无规则卷曲是红螯螯虾VWD结构域二级结构的主要元件,其中,α-螺旋占7.73％,β-转角占10.50％,延伸链占35.91％,无规则卷曲占45.86％.重组质粒pET-28a-VWD经大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞诱导表达即获得融合蛋白VWD,以2 mol/L盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析纯化及复性后,10％SDS-PAGE电泳和Western blotting检测均在蛋白相对分子量约20.0 kD处出现1条清晰的特异性条带,融合蛋白VWD表达形式以包涵体为主.融合蛋白VWD在BL21(λDE3)感受态细胞中高效表达的最佳诱导条件:当单克隆菌液OD600 nm达0.6时添加0.5 mmol/L IPTG,置于20℃下诱导培养16 h.纯化后的融合蛋白VWD浓度为1.32 mg/mL.[结论]通过全基因合成获得的优化红螯螯虾VWD基因能在大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中诱导表达出以包涵体为主要形式的融合蛋白,经盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析柱纯化及复性即可获得高纯度的活性VWD蛋白,为后续开展红螯螯虾Vg生物学功能研究及开发相应的生物活性物质提供技术支持.

关键词：红螯螯虾;卵黄蛋白原(Vg);VWD结构域;全基因合成;原核表达;包涵体

所属期刊栏目：52

分类号：S966.12(水产养殖技术)

资助基金：广西科技重大专项;广西自然科学基金项目;广西重点研发计划项目

在线出版日期：2021-08-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：1378-1386