金鱼HSC70和HSP40基因克隆及其原核表达

摘要：

[目的]克隆金鱼热激同源蛋白70(HSC70)和热休克蛋白(HSP40)基因,构建原核表达载体并通过IPTG诱导表达获得目的蛋白,明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能,为揭示金鱼的高温应答机制打下基础.[方法]提取金鱼鳃组织总RNA,利用RT-PCR扩增金鱼HSC70和HSP40基因,将目的基因片段克隆至线性空表达载体pET-32a上构建原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40,转化大肠杆菌Rosetta表达菌株后用IPTG进行诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白.[结果]金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp,编码650个氨基酸;金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp,编码332个氨基酸.金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃和草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%;HSP40氨基酸序列与斑马鱼的完全一致(相似度100.00%),与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%.原核诱导表达获得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,其大小约91.5和55.0 kD,均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应.[结论]HSC70和HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守,经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达,且携带有Trx标签,能与Anti-Trx抗体发生特异性反应,可作为互作蛋白用于RNA pull down试验.

关键词：金鱼、HSC70基因、HSP40基因、克隆、原核表达载体

所属期刊栏目：49

分类号：S965.811(水产养殖技术)

资助基金：国家自然科学基金项目KJZKJY13088

在线出版日期：2018-04-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：367-374