水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

摘要：

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P＜0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P＞0.05).[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.

关键词：水牛、RNA聚合酶Ⅲ启动子、7SK、U6、克隆、鉴定、基因沉默

所属期刊栏目：45

分类号：S823.83(家畜)

资助基金：国家“863”计划项目2011AA100607;国家转基因重大专项项目2011ZX08007-003

在线出版日期：2014-07-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：858-863