构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体及其转染对星形胶质细胞增殖的影响

摘要：

目的:构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体并进行鉴定,研究其转染星形胶质细胞后对细胞生长增殖的影响.方法:对实验室原有的pGFAP-IRES2-EGFP-p27质粒进行转化、扩增、抽提、酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序;通过设计引物,进行PCR扩增后分别获取GFAP启动子和p27基因片段,依次交换入线性化表达载体GV269和pDC315-GFAP-EGFP载体,最终构建pDC315-GFAP-p27-EGFP;将其转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测;转染星形胶质细胞后观察细胞生长和荧光表达情况;检测转染后星形胶质细胞细胞周期和凋亡比例、p27的表达情况.结果:经酶切鉴定和测序,成功鉴定真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27;经PCR鉴定和测序,成功构建重组腺病毒过表达载体pDC315-GFAP-p27-EGFP;经包装后,Ad-GFAP-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应,而且能够特异性地在星形胶质细胞中表达绿色荧光蛋白;经流式细胞仪分析,转染星形胶质细胞 72h后,与对照组相比,转染组处于S期的细胞比例下降,G1和G2期的细胞比例增高,凋亡比例增高(P＜0.05);转染后第5天,星形胶质细胞中p27蛋白表达水平较对照组有明显升高(P＜0.05).结论:利用腺病毒包装系统AdMax成功构建了携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒过表达载体,其可以特异性转染星形胶质细胞过表达p27,对星形胶质细胞的生长增殖有明显抑制作用.

关键词：p27、GFAP启动子、细胞周期、腺病毒载体、星形胶质细胞

所属期刊栏目：18

分类号：R741;R741.02;R743(神经病学与精神病学)

资助基金：湖北省自然科学基金青年基金项目No.2019CFB113

在线出版日期：2023-11-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：564-568,573