AATF-Che1超家族基因原核表达及其融合蛋白纯化

摘要：

目的 体外构建抗凋亡转录因子(AATF)-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pGEX-4T-1-AATF重组质粒扩增出AATF-Che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接AATF-Che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白AATF-Che1原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白AATF-Che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记(WB)法鉴定获得的纯化蛋白.结果 原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即AATF-Che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得AATF-Che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论 体外成功构建AATF-Che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-AATF-Che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究AATF-Che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础.

关键词：AATF-Che1超家族结构域、原核表达、融合蛋白纯化

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资助基金：Project No.81100349,supported by the National Natural Science Foundation of China;Project No.2011-WS-067,supported by Talents Summit in Six Major Industry Foundation of Jiangsu Provivce;国家自然科学基金项目81100349;江苏省“六大人才高峰”资助项目2011-WS-067

在线出版日期：2014-09-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：337-342