10.3760/cma.j.cn121382-20211218-00401
抗布鲁氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白VirB12纳米抗体的制备
目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体,为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼,从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA,通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆,ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列,最后得到个5非冗余序列,分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株,在16 ℃下进行胞间质可溶性表达,经Ni亲和柱纯化表达后,Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10
8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明,5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%,且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性;4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性,在90 ℃处理后,仍能保留60%以上的结合活性。
结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体,为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。
布鲁氏杆菌、VirB12、纳米抗体、噬菌体展示文库、热稳定性
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国家自然科学基金面上项目31570935;National Natural Science Foundation of China31570935
2023-05-30(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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