利用CRISPR-Cas9系统鉴定丙型肝炎病毒感染必需的胞内宿主因子

摘要：

目的 鉴定丙型肝炎病毒(HCV)感染过程必需的胞内宿主因子,为发现新的抗病毒靶点提供科学依据.方法 利用涵盖19 050个人类基因的CRISPR-Cas9文库小向导RNA(sgRNA)慢病毒感染人肝癌细胞Huh7.5(共计1×108个细胞),然后利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记筛选出成功敲除基因的细胞克隆群,再将细胞克隆群感染HCVJFH1株(感染复数为0.30),通过与未敲除的Huh7.5细胞(对照组)感染水平比较,筛选获得较对照组感染水平明显降低的细胞克隆群.最后通过Illumina测序获得该克隆被敲除的基因序列,利用短发夹RNA(shRNA)技术对单个基因分别验证,明确HCV感染必需的胞内宿主因子.结果 利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记成功筛选出经CRISPR-Cas9文库敲除基因的细胞克隆,利用免疫荧光检测获得了与对照组相比HCV感染水平明显下降的细胞克隆,将这些克隆进行Illumina测序,结果提示至少存在10个可能与HCV感染水平降低相关的基因.shRNA敲低单个基因验证结果显示,与未敲除的Huh7.5细胞相比,单独敲低MTCP1和RPS14基因的Huh7.5细胞的HCV感染率均降低,差异均具有统计学意义(均P＜0.05),表明MTCP1和RPS14是HCV感染必需的两个胞内宿主因子.结论 建立了利用CRISPR-Cas9系统鉴定HCV感染必需的胞内宿主因子的新方法,筛选出了MTCP1和RPS14这两个HCV感染必需的胞内宿主因子,为深入研究其作用机制奠定了基础,也为发现新的抗病毒靶点提供了科学依据.

关键词：CRISPR-Cas9、丙型肝炎病毒、宿主因子、敲除

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资助基金：广东省自然科学基金2016A020219003,2017A030310035;中山大学重大项目培育和新兴、交叉学科资助计划15ykjc06a Guangdong Natural Science Foundation2016A020219003,2017A030310035;Major Projects Cultivation and Emerging Interdisciplinary Funding Program of Sun Yat-sen University15ykjc06a

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：224-229,244