生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用

摘要：

目的 构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA, 并摸索最适生物素的添加剂量, 提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率, 从而优化生物素修饰蛋白制备方法.方法 采用PCR和引物退火的方法, 得到BirA基因片段和Avi-tag序列, 而后定向克隆至pcDNATM3. 1载体骨架上, 构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA.应用PCR方法扩增Her2 胞外段-Fc基因片段, 定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞, 并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果 经PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功. Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后, BirA酶在细胞中表达良好.在HEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后, 融合蛋白得到高效表达, 并且能够有效进行生物素修饰.随着生物素添加剂量的增加, 目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液 (5 mmol/L) 添加剂量为2 μl/ml时, 蛋白生物素修饰水平不再提高.结论 构建了生物素修饰蛋白真核表达载体, 优化了生物素修饰蛋白制备方法, 为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础.

关键词：BirA酶、Avi-tag、生物素修饰蛋白、真核表达载体

所属期刊栏目：16

分类号：Q75;Q78;Q81(分子遗传学)

资助基金：国家自然科学基金 81630069, 81802837

在线出版日期：2019-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1-6