荧光光谱法研究氨基改性介孔泡沫对DhaA的稳定化机理

摘要：

采用 F-4600 荧光光谱仪,对尿素和二甲基亚砜两种变性剂中烷基卤脱卤酶 DhaA在氨基改性介孔泡沫固定化前后的荧光光谱特征进行测定.运用荧光相图分析DhaA在两种变性剂中的去折叠过程,并结合活性残留率进行了变性过程热力学参数计算,比较固定化前后DhaA去折叠过程和热力学参数的区别.实验结果表明,DhaA催化活性随变性剂浓度增加而降低.相同变性剂浓度下,固定化DhaA能够比游离态DhaA保持更高的催化活性,在变性剂到达临界浓度之前(尿素浓度 5.5 mol·L-1 ,DMSO 浓度 7 mol·L-1 ),氨基改性介孔泡沫的稳定化作用显著.DhaA在尿素诱导下的变性过程符合"二态模型",而在 DMSO 诱导下符合"三态模型",DhaA中间态出现在浓度为 5.6 mol·L-1 .氨基改性介孔泡沫固定化不改变DhaA变性过程,但能够提高 DhaA 的去折叠热力学参数.在尿素诱导下,计算得到的 DhaA 初始吉布斯自由能变ΔG (H2 O)为8.51 kcal·mol-1 ,固定化后ΔG(H2 O)提高为9.55 kcal·mol-1 ;但由于尿素分子容易通过静电作用进入氨基介孔泡沫孔道,固定化后 DhaA 的溶液可及面积m由 3.6 9 kcal·(mol·mol·L-1 )-1增大到4.00 kcal·(mol·mol·L-1 )-1 ,孔道内的氨基、羟基能够通过氢键作用增强 DhaA的刚性,从而有效的降低了尿素可及面积增加带来的影响,提高了DhaA的尿素耐受性.在DMSO诱导下,计算发现游离态与固定化DhaA在折叠态向中间态转变过程中的ΔG(H2 O)均为 12.12 kcal·mol-1 ,由于孔道内的氨基、羟基能够有效阻碍非极性DMSO分子的进入,造成 m 从 3.3 9 kcal·(mol·mol·L-1 )-1降低为 2.30 kcal·(mol· mol·L-1 )-1 ;当DhaA从中间态向去折叠态转化时,DhaA内部疏水基团暴露导致m增加,由于孔道内极性微环境作用,固定化DhaA的m值(4.40 kcal·(mol·mol·L-1 )-1 )仍然低于游离态 DhaA(4.94 kcal· (mol·mol·L-1 )-1 ).荧光光谱法研究固定化对 DhaA 去折叠过程及热力学参数的影响是深入研究 DhaA稳定性的有效手段,能够为其他生物酶的稳定化机理研究提供方法指导.

关键词：DhaA、荧光光谱、稳定化机理、尿素、二甲基亚砜

所属期刊栏目：39

分类号：O657.3(分析化学)

资助基金：国家重点研发计划项目2016YFC0204205

在线出版日期：2020-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1779-1784