靶向大鼠糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白siRNA腺病毒载体的构建及对L6细胞的感染
目的：构建靶向大鼠糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（ GILZ）的siRNA腺病毒载体，并感染体外培养的大鼠L6成肌细胞，为进一步研究GILZ对脓毒症骨骼肌代谢的调控作用提供实验基础。方法（1）设计3条靶向大鼠GILZ mRNA的特异性siRNA序列和1条阴性对照序列，合成各序列的Oligo DNA，退火形成双链后，插入AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的载体GV119，构建腺病毒穿梭质粒，经测序证实构建成功后，与腺病毒骨架质粒pBHG lox△E1，3 Cre共转染HEK293细胞，获得重组腺病毒，分别命名为Ad－siRNA－1－GILZ、Ad－siRNA－2－GILZ和Ad－siRNA－3－GILZ，扩增纯化后测定病毒滴度。（2）0.1、1.0、10.0μL重组腺病毒在不同类型培养液（完全培养液、Enhanced Infection Solution、含5μg／mL Polybrene的完全培养液、含5μg／mL Polybrene的Enhanced Infection Solution）中感染L6细胞，显微镜下观察L6细胞形态改变和绿色荧光蛋白表达情况，确定最佳感染条件。（3）分别以阴性对照病毒（阴性对照组）、Ad－siRNA－1－GILZ（Ⅰ组）、Ad－siRNA－2－GILZ（Ⅱ组）和Ad－siR-NA－3－GILZ（Ⅲ组）感染L6细胞，Real time－PCR检测各组GILZ mRNA的表达量。结果（1）经测序分析和PCR验证，成功构建重组腺病毒载体，经测定滴度为2.0×1010 PFU／mL。（2）10μL重组腺病毒在Enhanced Infec-tion Solution的感染效果最佳，感染效率达80％。（3）重组腺病毒感染L6细胞后，细胞无明显坏死，荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达。（4） Real time－PCR结果显示，Ⅱ、Ⅲ组GILZ mRNA表达量与阴性对照组比较差异无统计学意义（ P＞0.05），Ⅰ组GILZ mRNA表达量较阴性对照组明显降低（ P＜0.01），其沉默效率为59.8％。结论成功构建靶向大鼠GILZ的siRNA腺病毒载体，并可在体外细胞水平明显下调GILZ的表达，为后续研究GILZ对脓毒症骨骼肌蛋白代谢的调控作用提供实验基础。
脓毒症、糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白、siRNA、RNA干扰、腺病毒载体
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R68;S82
湖北省自然科学基金资助项目编号2014CFB620
2016-05-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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