成纤维细胞Ⅰ型胶原基因shRNA载体的构建及干扰效果
目的 构建有效针对人成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,检测RNA干扰后对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法 设计合成4对针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA靶序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4),将合成的shRNA片段通过重组技术克隆到真核表达载体pmU6,经酶切与测序验证表明成功构建针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4),并将该干扰载体与空载体分别通过脂质体转染人的病理性瘢痕成纤维细胞(依次为Col-shRNA1组、Col-shRNA2组、Col-shRNA3组、Col-shRNA4组、空载体转染组),另选未处理的成纤维细胞作为空白对照组,采用RT-PCR与羟脯氨酸含量测定试剂盒检测该干扰载体的干扰效应.结果 酶切与测序结果表明成功构建了针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体.Ⅰ型胶原基因mRNA的相对表达水平在空白对照组与空载体转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05);而干扰组Col-shRNA(1～4)与空载体转染组之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).空白对照组与空载体转染组的羟脯氨酸含量及胶原合成差异无统计学意义,干扰组(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4)的羟脯氨酸含量和胶原合成与空载体转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功构建了4组有效针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,它们均能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达与减少细胞胶原的合成,其中Col-shRNA1对成纤维细胞Ⅰ型胶原基因表达的干扰效果最强.
病理性瘢痕、成纤维细胞、Ⅰ型胶原、短发夹RNA、基因沉默
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广东省自然科学基金资助项目9151008002000010
2015-03-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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