hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

摘要：

目的 构建hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础.方法 通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF_(165)基因片段,并克隆到pMD-19T载体.将目的 基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF_(165)依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上.线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒.重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化.通过荧光计数确定病毒感染滴度.结果 克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF_(165)基因的PCR产物,滴度测定为5×109 pfu/mL.结论 成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础.

关键词：hBcl-2基因、hVEGF165基因、双基因共表达、腺病毒载体

所属期刊栏目：31

分类号：R37;R39

资助基金：广东省国际科技合作计划项目2006B50107005

在线出版日期：2010-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：319-322