10.3969/j.issn.1001-9448.2005.08.014
巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体
目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体.方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5a,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析.结果重组质粒PCR扩增得到1568的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%.结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法,可用于基因的检测和载体的构建.
巢式-PCR、细胞色素P450基因、T载体、测序分析
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R3(基础医学)
广东省自然科学基金0125042
2005-09-01(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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