应用AdEasier-1系统高效制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒

摘要：

背景及目的:自杀基因疗法的瓶颈之一是自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平低.利用肿瘤特异性启动子来调控自杀基因使其在肿瘤细胞中特异性表达已成为肿瘤自杀基因研究的热点.研究证实血管内皮生长因子在绝大多数实体瘤细胞中都有过量表达而在正常组织中不表达或表达甚微,其过量表达与血管内皮生长因子启动子( vascular endothelial growth factor promoter,VEGFP)活性上调有关.为研究 VEGFP可否提高 TK自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平,本研究应用一种高效的重组腺病毒构建系统,即 AdEasier 1系统制备含 VEGFP驱动 TK自杀基因的重组腺病毒.方法: VEGFP自 pEGFP 1 SV VEGFP切下后插入 pAdtrack载体上构建 pAdtrack VEGFP.用 Hind Ⅲ /XbaⅠ自 pREP8 TK切出带 polyA加尾信号的 TK基因,亚克隆到 pAdtrack VEGFP中构建转移质粒 pAdtrack VEGFP TK. PmeⅠ酶线性化转移质粒 pAdtrack VEGFP TK,转化含腺病毒基因组质粒 pAdEasy 1的细菌 AdEasier 1,用 25 μ g/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和 PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒 pAdEasy VEGFP TK,经 293细胞包装、扩增获得重组腺病毒 Ad VEGFP TK,行酶切鉴定、 PCR鉴定和测序.结果:卡那霉素抗性细菌只有两种,一种含 pAdEasy VEGFP TK(大于 33 kb),另一种含 pAdtrack VEGFP TK(约 12 kb),两者容易经琼脂糖电泳加以鉴别.经 PacⅠ酶切后,重组腺病毒质粒可产生一大于 33 kb的大片段和一约为 3 kb的特征性小片段.构建重组腺病毒质粒的成功率为 60%( 6/10).包装扩增后重组腺病毒的滴度为每毫升 5.6× 1012病毒颗粒, BamHⅠ和 SpeⅠ酶切后重组腺病毒分别产生 5 kb和 11 kb大小的特征性片段; PCR扩增结果与预期相符.申友生物技术有限公司测序结果正确,错误率 < 1%.结论:应用 AdEasier 1系统可以高效快速制备含 VEGFP驱动 TK自杀基因的重组腺病毒.

关键词：肿瘤、重组腺病毒、载体、自杀基因治疗、血管内皮生长因子

所属期刊栏目：23

分类号：R73.36(肿瘤学)

资助基金：国家高技术研究发展计划863计划2001AA217171;广东省自然科学基金013072

在线出版日期：2004-10-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1093-1097