小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定

摘要：

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种高度保守性的真核细胞中普遍存在的丝/苏氨酸激酶,它的活性在人的许多肿瘤细胞是升高的,可作为一种癌基因起作用. 为了深入进行 CK2结 构与功能的研究,本研究拟构建小鼠蛋白激酶 CK2α亚基 cDNA重组表达质粒,并进行表达和初 步鉴定. 方法 : 通过反转录 PCR从 NIH 3T3小鼠成纤维细胞获得小鼠 CK2α亚基编码区 cDNA. 将 NdeⅠ /BamH I双酶切 PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体 pT7-7进行定向克隆. 转化感受态大肠杆菌 DH5α获得转化子,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化 子,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定. 随机挑选 4个阳性克隆进行 DNA测序,将序列完全 正确的重组质粒转化表达菌 BL21(DE3), 挑单克隆小量培养,IPTG诱导表达,Western blot鉴 定. 结果 : 转化子的阳性筛选率为 100% ; 限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的 大小与理论推测值相符. DNA正反向测序结果表明 : 从 4个阳性克隆中筛选到 1个 PCR过程不产 生突变的重组质粒,并将其质粒命名为 pTMCKA. 重组质粒转化表达菌经 IPTG诱导后出现一分 子量 42 kDa蛋白过度表达,Western blot结果证明过度表达产物能与抗人 CK2α亚基抗体发生 特异性免疫反应. 结论 : 重组小鼠蛋白激酶 CK2α亚基的克隆表达获得成功.

关键词：α催化亚基/蛋白激酶CK2/小鼠、分子克隆、DNA测序、表达、免疫印迹

所属期刊栏目：21

分类号：Q555+.7;Q784;Q523+.8;Q786(酶)

资助基金：广东省自然科学基金011766;广东省湛江市科技局科研项目;广东医学院校科研和教改项目XK0002

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：751-756