10.3969/j.issn.1000-467X.2001.01.028
PCR克隆技术构建抑癌基因NOEY2真核表达载体
@@在肿瘤分子生物学研究中,经常需要对PCR产物进行克隆,其最基本目的是为被检测的基因留下一份硬拷贝。基于PCR的克隆方法很多,最常被提到的策略是预先于引物的5′端设置限制性酶切位点,PCR产物经酶切后再与线性化的载体相连接[1,2]。但是,某些常用的限制性内切酶对线性PCR产物双链末端的位点识别和切割效率很差,这一路线有时难以实现[3]。最近我们利用这种方法构建最新报道的抑癌基因NOEY2的真核表达质粒失败后,改用T/A策略作为过渡,很快获得成功,现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及设备
Raji细胞株和大肠杆菌DH5α由本室保种。总RNA提取试剂Trizol,购自Gibcol BRL公司。逆转录PCR试剂:MMLV、RNasin、OligodT、dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、T4DNA连接酶、pGEMT载体均购自Promega公司。真核表达载体pc DNA3来自Invitrogen公司。引物合成:北京赛百胜公司。凝胶DNA纯化试剂盒QIAEXII购自Qiagen公司。PE9700型热循环仪、ABI310型自动DNA测序仪及测序试剂(BigDye Terminator Kit等),均为Perkin-Elmer公司产品。
PCR克隆、NOEY2基因、真核表达载体
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Q784(基因工程(遗传工程))
2004-01-08(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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