PCR克隆技术构建抑癌基因NOEY2真核表达载体

摘要：

@@在肿瘤分子生物学研究中，经常需要对PCR产物进行克隆，其最基本目的是为被检测的基因留下一份硬拷贝。基于PCR的克隆方法很多，最常被提到的策略是预先于引物的5′端设置限制性酶切位点，PCR产物经酶切后再与线性化的载体相连接[1，2]。但是，某些常用的限制性内切酶对线性PCR产物双链末端的位点识别和切割效率很差，这一路线有时难以实现[3]。最近我们利用这种方法构建最新报道的抑癌基因NOEY2的真核表达质粒失败后，改用T/A策略作为过渡,很快获得成功,现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及设备
Raji细胞株和大肠杆菌DH5α由本室保种。总RNA提取试剂Trizol，购自Gibcol BRL公司。逆转录PCR试剂：MMLV、RNasin、OligodT、dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、T4DNA连接酶、pGEMT载体均购自Promega公司。真核表达载体pc DNA3来自Invitrogen公司。引物合成：北京赛百胜公司。凝胶DNA纯化试剂盒QIAEXII购自Qiagen公司。PE9700型热循环仪、ABI310型自动DNA测序仪及测序试剂(BigDye Terminator Kit等)，均为Perkin-Elmer公司产品。

关键词：PCR克隆、NOEY2基因、真核表达载体

所属期刊栏目：20

分类号：Q784(基因工程（遗传工程）)

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共2页

页码：99-100