慢病毒介导shRNA沉默LAMP-2A和TSG101表达对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响

摘要：

目的 采用慢病毒介导的shRNA干扰技术,下调PC12细胞中溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP-2A)和肿瘤易感基因101 (tumor susceptibility gene 101,TSG101)的表达,并研究其对EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响.方法 以LAMP-2A和TSG101为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Puro 载体连接获得重组慢病毒载体;将其与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,收集并浓缩上清液获得重组病毒,测定病毒滴度;病毒颗粒转染PC12细胞,经嘌呤酶素筛选获得稳定感染细胞株;Western blot检测LAMP-2A和TSG101蛋白的表达;分别采用LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1下调PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达,并结合巴佛洛霉素A1处理,研究其对PC12细胞中EGFP-α-synuclein (A53T)、EGFP、α-synuclein (A53T)和LC3B蛋白的影响,免疫荧光检测各组PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达.结果 成功构建干扰LAMP-2A和TSG101表达的慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,Western blot检测结果显示LAMP-2AshRNA2和TSG101 shRNA1干扰效果最好;下调LAMP-2A和TSG101蛋白表达均能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的降解(P＜0.01),并提高LC3-Ⅱ蛋白的含量(P＜0.01).结论 慢病毒介导的shRNA能有效地沉默PC12细胞中LAMP-2A和TSG101的表达,抑制细胞中EGFP-α-synuclein (A53T)的降解.

关键词：溶酶体相关膜蛋白-2A、肿瘤易感基因101、慢病毒、α-突触蛋白、PC12细胞

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分类号：R394-33;R394.3;R742.5

资助基金：国家自然科学基金青年基金31201045;四川省应用基础研究计划2012JY0113;四川省教育厅科研项目13ZB0094;成都医学院自然科学基金CYZ11-007Supported by the National Natural Science Foundation for Young Scholars of China 31201045,the Project of Applied Basic Research Program of Sichuan Province 2012JY0113,the Project of Sichuan Committee of Education 13ZB0094 and the Natural Science Foundation of Chengdu Medical College CYZ11-007.

在线出版日期：2015-08-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1393-1399