两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

摘要：

为了选择合适载体,获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶,本研究以茶树叶片为材料,克隆茶树多酚氧化酶基因(CsPPO),切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体,分别命名为pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-Cs PPO43、pMALc5X-CsPPO70,利用E.coil Transetta(DE3)菌株进行表达,经SDS-PAGE电泳检验,pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取,大量出现在上清液中;而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中.利用邻苯二酚、ECG、EC 3种底物在410 nm处检测CsPPO蛋白活性发现,pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显"S"型变化,表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程.pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X-CsPPO70的高,其中pMALc5X-CsPPO43与EC反应时酶比活力最高,最大比活力为1.45×106 U·mg-1.因此,可利用pMALc5X-CsPPO43合成工业用PPO,为进一步研究其与儿茶素的反应机理,利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础.

关键词：茶树、多酚氧化酶、原核表达、酶活性

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分类号：TS272.2;Q52(食品工业)

资助基金：国家现代农业产业技术体系建设专项资金CARS-19;国家自然科学基金31470690;江苏省现代农业产业技术体系sxgc2017223;南京农业大学 SRT 项目1614C12

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：396-405