探讨FABD结构域对Bcr/Abl蛋白定位及功能的影响

摘要：

目的:构建F-actin结合结构域(F-actin binding domain,FABD)缺失腺病毒载体Ad-Bcr/Abl-ΔFABD和野生型Bcr/Abl腺病毒载体Ad-Bcr/Abl,探讨FABD结构域对Bcr/Abl蛋白定位及功能的影响.方法:PCR扩增bcr/abl和bcr/abl-ΔFABD片段,双酶切后克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,经AdEasy构建系统获得腺病毒Ad-Bcr/Abl-ΔFABD和Ad-Bcr/Abl,并在HEK293细胞中进行包装.将细胞分为3组,Ad-GFP组、Ad-Bcr/Abl组以及Ad-Bcr/Abl-ΔFABD组,分别加入对应的腺病毒.Western blot验证Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD在293T细胞中的表达水平,间接免疫荧光法检测Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD在293T细胞中的定位.流式细胞术、MTT法分别检测Bcr/Abl和Bcr/Abl-AFABD对293T细胞凋亡、增殖的影响.结果:双酶切以及测序验证穿梭质粒构建正确;Pac Ⅰ酶切验证重组腺病毒质粒重组成功;绿色荧光显示重组腺病毒包装成功;Western blot验证Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD可在293T细胞中表达;间接免疫荧光发现Bcr-Abl蛋白在细胞内的分布依赖于F-actin;FABD缺失后虽然不能使Bcr/Abl入核,但使其在细胞内的分布方式由均匀变为点状或块状聚集;FABD缺失后,Bcr/Abl在细胞内呈块状聚集的方式与IM处理后的结果相似.流式细胞术和MTT结果显示,与Bcr/Abl相比,Bcr/Abl-ΔFABD组293T细胞的凋亡比例增加(P＜0.05),增殖能力降低(P＜0.05).结论:成功构建Ad-BcdAbl和Ad-Bcr/Abl-ΔFABD重组腺病毒,FABD缺失后使Bcr/Abl蛋白在细胞质中的分布方式发生改变,并能抑制Bcr/Abl的抗凋亡能力和促增殖能力.

关键词：Bcr/Abl、FABD、细胞定位、来普霉素、伊马替尼

所属期刊栏目：42

分类号：R733.7;R329.2;R542.2

资助基金：国家自然科学基金;重庆市基础与前沿研究计划资助项目

在线出版日期：2017-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1477-1483