HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

摘要：

目的:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标签的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X pro-tein,HBx)特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定.方法:将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果.结果:酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达(P=-0.01).结论:成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.t5细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础.

关键词：重组腺病毒、乙型肝炎病毒X蛋白、shRNA、肝细胞肝癌

所属期刊栏目：38

分类号：R373.2(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：重庆市渝中区软科学研究资助项目20110213;国家临床重点专科护理建设资助项目财社[2010]305号

在线出版日期：2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：1425-1428