pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定

摘要：

目的:构建可诱导表达pri-mir-302/367的慢病毒载体,并研究miR-302/367家族基因miR-302a/b/c/d和miR-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在HeLa细胞中的诱导性表达.方法:以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增pri-mir-302/367基因.经双酶切后连接入pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定.将重组质粒和辅助质粒共同转染293 FT细胞,并测定病毒滴度.用病毒转染HeLa细胞,强力霉素(doxycline,DOX)诱导后,通过real-time PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达.实验分为诱导组(DOX+)、非诱导组(DOX-)和空白组(blank).结果:酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功,病毒滴度为5×106 TU/ml;DOX诱导72 h后,real-time PCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组(P＜0.05,其中miR-302a:PDOX+vsmX-=0.032,PDOX+vs.blank=0.048;miR-302b:POX+vs.POX-=0.001,PDOX+vs.blank=0.001;miR-302c:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=0.000;miR-302d:PDOX+vs.DOX-=0.002,PDOX+vs.blank=0.047;miR-367:PDOX+vs.DOX-=0.001,PDOX+vs.blank=0.001;OCT4:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=O.001;SOX2:PDOX+vs.DOX-=0.000,PoX+vvs.blank=0.000;NANOG:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=0.000),而非诱导组与空白组相比差异无统计学意义(P＞0.05,其中miR-302a:Pblankvs.DOX_=0.057;miR-302b:Pblankvs.DOX_=0.832;miR-302c:Pblank vs.DOX-=0.445;miR-302d:Pblank vs.DOX_=0.979;miR-367:Pblank vs.DOX-=0.161;OCT4:Plank vs.DOX-=0.051;SOX2:Plank vs.DOX-=0.060;NANOG:Pblank vs.DOX-=0.078).结论:成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体,为后续的重编程研究奠定了实验基础.

关键词：pri-mir-302/367、Tet-on系统、可诱导性慢病毒载体、HeLa细胞

所属期刊栏目：38

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81160098

在线出版日期：2014-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1409-1413