家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备

摘要：

Argonaute (AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用.基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择BmAGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础.通过分析BmAGO2蛋白的抗原性分布,筛选出BmAGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体pColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠.剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合.以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3.经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的BmAGO2单克隆抗体.利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞BmN以及家蚕5龄幼虫的内源BmAGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的BmAGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA.

关键词：家蚕、BmAGO2蛋白、单克隆抗体、免疫共沉淀

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分类号：S881.2;Q786(蚕桑)

资助基金：国家自然科学基金项目31772677;浙江省自然科学基金项目LY16C170002

在线出版日期：2018-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：376-381