人COX1蛋白真核表达载体的构建及其生物信息学分析
目的:构建表达重组环氧合酶1 (COX1)真核表达载体,验证其体外能够催化底物合成前列腺素E1 (PGE1),以寻找高效获得PGE1的方法.方法:提取人微血管内皮细胞(HMECs)总RNA,逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增人COX1基因,经双酶切后与真核表达载体pCMV6连接,构建重组pCMV6-COX1真核表达质粒.通过生物信息学在线工具分析COX1蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构.采用脂质体将重组质粒转染至HEK-293F细胞中,将细胞随机分为对照组(未转染重组质粒的HEK-293F细胞)、转染重组质粒2d组和转染重组质粒5d组,分别收集细胞和细胞培养上清,Western blotting法检测COX1蛋白表达水平.比较真核表达的COX1蛋白与羊精囊提取法制备的粗酶混合物催化底物二高-γ-亚麻酸合成PGE1的酶活性.结果:经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建pCMV6-COX1重组载体,目的基因长度约为1 800 bp.生物信息学分析,COX1蛋白为水溶性蛋白,1～53位氨基酸为信号肽,34～53位氨基酸处于跨膜区域,有36个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和9个酪氨酸磷酸化位点.二级结构预测,不规则卷曲所占比例为46.20％,其次为α螺旋占41.03％.延伸链和β-转角分别占10.18％和2.58％.Western blotting法检测,重组质粒成功转染至HEK-293F细胞中,与转染重组质粒2d组比较,转染重组质粒5d组细胞培养上清中COX1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),蛋白相对分子质量为70 000.当底物浓度为1％时,COX1蛋白催化底物合成PGE1的含量为(50.01±1.37) ng·L-1,其活性相当于5个羊精囊制备的粗酶活性的(90.30±0.06)％.结论:通过基因工程技术构建和表达的COX1蛋白能够催化底物合成PGE1并满足临床要求.
前列腺素E1、环氧合酶1、真核表达、重组载体、催化活性
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Q78(基因工程（遗传工程）)
吉林省教育厅科研项目资助课题;吉林省科技厅科研项目资助课题;吉林省中医药管理局科研项目资助课题;吉林省大学生创新创业训练项目资助课题
2020-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
745-750
