携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

摘要：

目的:构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率.方法:利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒.以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒.经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达.结果:PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3 400、110和720 bp.酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4 300 bp.测序分析,目的基因1 547位点发生了突变.利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致.重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP.流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%.结论:成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染.

关键词：人端粒酶逆转录酶、绿色荧光蛋白、质粒构建

所属期刊栏目：43

分类号：Q785(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金资助课题81202379

在线出版日期：2017-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：213-219,封2