肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

摘要：

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因( ldhD),将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100％正确.将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21( DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21( DE3) -pET-22b(+)-ldhD基因工程菌.重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21( DE3)中成功表达.采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10 mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04 U/mL的酶活力；底物D-乳酸终浓度为50 mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力.比酶活则分别为9.16 U/mg和0.07 U/mg.通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数KM为10.54 mmol/L.经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09 g/L.

关键词：D-乳酸、D-乳酸脱氢酶基因、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌

所属期刊栏目：39

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金20636010;国家“973”计划2011CB710805;国家转基因重大专项2008ZX08012-001

在线出版日期：2012-05-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：79-83