利用限制性酶切-组装方法构建携带双报告基因的猴1型腺病毒载体

摘要：

限制性酶切-组装是构建和改造腺病毒载体的一种简便方法,本研究用该方法构建同时携带GFP和萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,Fluc)报告基因的猴1型腺病毒(Simian Adenovirus 1,SAdV-1)载体.PCR分别扩增GFP和Fluc基因,重叠延伸PCR将两个目的基因通过T2A短肽编码序列串联得到融合基因GFluc.限制性内切酶SpeI酶切腺病毒质粒pKSAV1-EG,去除原有的外源基因,将载体片段与GFluc片段进行限制性酶切-组装,产物转化大肠杆菌感受态细胞,获得腺病毒质粒pKSAV1-GFluc.通过限制性内切酶酶切分析、PCR产物测序证实质粒构建正确.pKSAV1-GFluc质粒经SwaI酶切线性化后转染SAdV-1包装细胞系293SE13,4 d后GFP+细胞形成荧光灶,并持续增大,表明重组病毒拯救成功;对重组病毒基因组进行了限制性酶切鉴定.扩增病毒并进行纯化,在细胞水平和动物模型中检测到目的蛋白GFP和Fluc的表达.本研究成功构建同时携带GFP和Fluc报告基因的SAdV-1载体,显示了限制性酶切-组装方法的易用性和可靠性,并为研究SAdV-1载体在小鼠模型的组织分布奠定基础.

关键词：报告基因、限制性酶切-组装、猴1型腺病毒、载体

所属期刊栏目：39

分类号：R373.9(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：国家自然科学基金82161138001;COVID-19

在线出版日期：2023-06-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：791-799