利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系

摘要：

本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(Integrin αV,ITGαV)及整合素β3(Integrin β3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制.根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR-V2载体上,与辅助质粒pSPAX2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选.用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系.对分离出的ST-ITGαVKO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST-ITGβ3KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除.采用敲除细胞系进行PDCoV感染试验,结果表明敲除ITGαV、ITGβ3基因均可抑制PDCoV在ST细胞内的增殖,成功构建的ST-ITGαVKO及ST-ITGβ3KO细胞系为后续阐明ITGαV、ITGβ3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型.

关键词：整合素αV、整合素β3、CRISPR/Cas9、猪睾丸细胞、猪δ冠状病毒

所属期刊栏目：39

分类号：S828.9(家畜)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;河南省高校科技创新人才支持项目

在线出版日期：2023-05-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：491-498