Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造

摘要：

重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略.拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点.软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上.PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒.BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP.PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点.研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造.

关键词：腺病毒载体、改造、Gibson组装

所属期刊栏目：34

分类号：R373.9(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：山东省自然科学基金;国家重点研发计划

在线出版日期：2018-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：661-667