利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

摘要：

为了构建人5型腺病毒 (HAdV-5) 的感染性克隆, 我们使用了Gibson DNA组装技术.设计1对引物用于扩增质粒骨架 (包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点, KAN-ORI), 在引物的5'端添加HAdV-5基因组末端序列 (约30NT) 和Pac I位点, 以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板, PCR扩增得到KAN-ORI片段, 该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列.将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合, 进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞, 涂布含卡那霉素的LB琼脂平板.挑取菌落, 提取质粒, 命名为pKAd5.限制性酶切鉴定的结果显示, 所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组.使用Pac I酶切线性化pKAd5, 利用脂质体转染293细胞, 转染4d后单层细胞出现病毒噬斑.拯救的病毒能够在Hep-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA, 酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同, 证实HAdV-5得到成功拯救.上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行, 为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路.

关键词：人5型腺病毒 (HAdV-5)、Gibson DNA组装、感染性克隆、病毒拯救、透射电子显微镜

所属期刊栏目：34

分类号：R373.9(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

在线出版日期：2018-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：349-355