Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

摘要：

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少.本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型.将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体.运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF.遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达.感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响.限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确.病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高.在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白.这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达.Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间.这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础.

关键词：慢病毒诱导表达、Tet-On3G、pUL23、人巨细胞病毒(HCMV)、慢病毒

所属期刊栏目：33

分类号：R373.9(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：国家自然科学基金30770106;题目:人巨细胞病毒蛋白pUL23抑制病毒自身繁殖的分子机理;广东省自然科学基金重点项目06025162 2016A030311048;题目:SUMO化修饰介导的人巨细胞病毒与γ干扰素途径相互作用的分子机制;National Natural Science Foundation of ChinaGrant 30770106;Title:The molecular mechanism of HCMV growth defection caused by pUL23;Natural Science Foundation of Guangdong Province,ChinaGrant 060251622016A030311048;Title:Molecular Mechanism of Interaction between Human Cytomegalovirus and Interferon γ-dependent Signal Pathway

在线出版日期：2017-07-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：550-557